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制药领域

1.无菌检查法(以下内容摘自《中国药典2010版第二部》
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。该方法中多次用到定量质控微生物。
1.1 无菌检查法——培养基的灵敏度检查
  (1)接种量:小于100CFU试验
(2)试验菌种类:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)
白色念珠菌(Candida albicans)
黑曲霉(Aspergillus niger)
  (3)步骤:
取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基9 支,分别接种小于100 CFU 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 支,另1 支不接种作为空白对照,培养3 天;取每管装量为9ml 的改良马丁培养基5 支,分别接种小于100CFU 的白色念珠菌、黑曲霉各2 支,另1 支不接种作为空白对照,培养5 天。逐日观察结果。
结果判定:空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定。
1.2无菌检查法——方法验证试验
    当建立产品的无菌检查法时,应进行方法的验证,以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时,检查方法应重新验证。验证时,按“供试品的无菌检查”的规定及要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证
(1)接种量:小于100CFU试验菌
  (2)试验菌种类:大肠埃希菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)
白色念珠菌(Candida albicans)
黑曲霉(Aspergillus niger)
  (3)步骤:
    薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入小于100 CFU的试验菌,过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中,或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照。置规定温度培养3~5 天,各试验菌同法操作。
直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8 管,分别接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4 管,分别接入小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中1 管接入每支培养基规定量的供试品量,另1 管作为对照,置规定的温度培养3~5 天。
结果判断与对照管比较,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法,消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法验证试验。
1.3无菌检查法——供试品的无菌检查——阳性对照
(1)接种量:小于100CFU试验菌
(2)试验菌种类:应根据供试品特性选择阳性对照菌:无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌;抗厌氧菌的供试品,以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品,以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验,加菌量小于100CFU,供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48~72小时应生长良好。
 
2.微生物限度检查法(以下内容摘自《中国药典2010版第二部》
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数——计数培养基的适用性检查
(1)接种量:50~100CFU试验菌
  (2)试验菌种类:大肠埃希菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
白色念珠菌(Candida albicans)
黑曲霉(Aspergillus niger)
  (3)步骤:
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100CFU,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,每株试验菌平行制备2 个平皿,混匀,凝固,置30~35℃培养48 小时,计数;取白色念珠菌、黑曲霉各50~100CFU,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72 小时,计数;取白色念珠菌50~100CFU,注入无菌平皿中,立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,平行制备2 个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72 小时,计数。同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
结果判定被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。
2.2 细菌、霉菌及酵母菌计数——计数方法的验证
当建立产品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。
(1)接种量:50~100CFU试验菌
  (2)试验菌种类:大肠埃希菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
白色念珠菌(Candida albicans)
黑曲霉(Aspergillus niger)
  (3)步骤:验证试验至少应进行3 次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
①试验组平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50~100CFU 试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50~100CFU试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数。
②菌液组测定所加的试验菌数。
③供试品对照组取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
④稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml 供试液含50~100CFU,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判定在3 次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
若没有适宜的方法消除供试品的抑菌作用,那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的,同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是,供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用,而对其他菌株没有抑制作用。因此,根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则,在不影响检验结果判断的前提下,应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求,应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。
计数方法验证时,采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。
2.3 控制菌检查­——培养基的适用性检查
(1)接种量:不大于100CFU、50~100CFU或不少于100CFU
  (2)试验菌种类:大肠埃希菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)
白色念珠菌(Candida albicans)
(3)步骤:控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。各培养基的检测项目及所用菌株见下表1。
 
表2 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示能力检查
控制菌检查 培养基 特性 试验菌株
大肠埃希菌 胆盐乳糖培养基
 
4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基
曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基
促生长能力
抑制能力
促生长能力+ 指示能力
促生长能力+ 指示能力
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
大肠埃希菌
大肠菌群 乳糖胆盐发酵培养基
 
乳糖发酵培养基
曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基
促生长能力
抑制能力
促生长能力+ 指示能力
促生长能力+ 指示能力
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
大肠埃希菌
沙门菌
 
营养肉汤培养基
四硫磺酸钠亮绿培养基
 
胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺氏属琼脂培养基
曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基
三糖铁琼脂培养基
促生长能力
促生长能力
抑制能力
促生长能力+ 指示能力
 
促生长能力+ 指示能力
指示能力
乙型副伤寒沙门菌
乙型副伤寒沙门菌
金黄色葡萄球菌
乙型副伤寒沙门菌
 
乙型副伤寒沙门菌
乙型副伤寒沙门
铜绿假单胞菌 胆盐乳糖培养基
 
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
 
绿脓菌素测定用培养基
促生长能力
抑制能力
促生长能力
抑制能力
促生长能力+指示能力
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌 亚碲酸盐肉汤培养基
 
卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基
促生长能力
抑制能力
促生长能力+指示能力
抑制能力
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
梭菌 梭菌增菌培养基
哥伦比亚琼脂培养基
促生长能力
促生长能力
生孢梭菌
生孢梭菌
白色念珠菌 沙氏葡萄糖液体培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基
念珠菌显色培养基
 
1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基
促生长能力
促生长能力+指示能力
促生长能力+指示能力
抑制能力
促生长能力+指示能力
白色念珠菌
白色念珠菌
白色念珠菌
大肠埃希菌
白色念珠菌
 
液体培养基促生长能力检查:分别接种不大于100CFU的试验菌(见表1)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好。
固体培养基促生长能力检查:取试验菌各0.1ml(含菌数50100CFU)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。
培养基抑制能力检查:接种不少于100CFU的试验菌(见表1)于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养,试验菌应不得生长
固体培养基指示能力检查:取试验菌各0.1ml(含菌数不大于100CFU)(见表1)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
液体培养基指示能力检查:分别接种不大于100CFU的试验菌(见表1)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。
2.4 控制菌检查­——方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查方法应重新验证。
验证时,依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。
1)接种量:10~100CFU
  (2)试验菌种类:大肠埃希菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)
白色念珠菌(Candida albicans)
3)步骤:取规定量供试液及10100CFU试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
结果判断若上述试验检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若试验组未检出试验菌,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
2.5 控制菌检查­——供试品检查——阳性对照
1)接种量:10~100CFU
  (2)试验菌种类:大肠埃希菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)
白色念珠菌(Candida albicans)
3)供试品进行控制菌检查时,应做阳性对照试验。阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加菌量为10100CFU。阳性对照试验应检出相应的控制菌。
 
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